背景
辉瑞公司资深药物化学家Lipinski在2001年提出的筛选类药分子的五条基本法则，简称，Rule of 5(Ro5), 简称五规则因为都和数字5有关。Lipinski五规则的内容是：分子量小于500，氢键给体 (包括羟基、氨基等)的数量不超过5个，氢键受体的数量不超过10个，化合物的油水分配系数的对数值 (logP) 不超过5。符合五规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物。在药物研发领域，Lipinski五规则被广泛用于对化合物库的初筛，以期摒除那些不适合成为药物的分子，缩小筛选的范围并降低药物研发成本。
此规则的目的是使化合物的设计过程更加合理，以免产生非极性，结构松散且过大的分子，从而提高口服生物利用度和其他所需的药物ADME特性。尽管Ro5一直是指导开发口服药物的有用方针，但当今医学实践中使用的许多疗法都是通过胃肠外给药，而且艾伯维公司的科学家从超越五规则（bRo5）的药物研发项目中总结出的观察结果显示许多违反Ro5的化合物都是很好的候选药物，例如一些天然产物属于bRo5但也有很好的生物利用度，FDA批准的激酶抑制剂中三成是bRo5以及阻断PPI的小分子中50%是bRo5，这直接推动了越来越多的人开始在Ro5以外的化学空间进行药物开发。乌普萨拉大学的Doak等人选择了48种bRo5化合物及其靶标，深入研究了每个特定配体-受体间的相互作用，本文描述了对其中的37个bRo5靶标及其可用配体的实质性扩展分析。
bRo5靶标的结合位点分析
对37种靶蛋白的分析集中在蛋白-配体结构的结合热点上。热点（hot spot）是蛋白质表面上对配体结合自由能贡献不成比例的小区域，因此配体通常与一个或多个热点重叠。作者使用蛋白质作图程序FTmap(http://ftmap.bu.edu/)来确定结合热点。FTmap在要研究的蛋白质表面上分布大小，形状和极性不同的有机探针小分子，找到每种探针类型最有利的位置，对探针进行聚类并根据其平均能量对聚类进行排名。结合几个不同探针簇的区域称为共有位点，即为预测的结合热点。预测的热点与通过实验方法确定的热点一致。此外，热点的强度（探针簇的数量）表明在结合小分子的情况下，热点相对能量的重要性。
根据每种蛋白质上包含的探针簇的热量对热点进行排名，最强的热点从0开始编号，每个热点中探针簇的数量显示在热点排名后的括号中。根据热点集合的不同结构，将37个靶标分为“复杂”和“简单”两类，复杂的热点结构含有四个或更多热点的结合位点，平均探针簇为68.88，简单的热点结构具有三个或更少的热点，平均探针簇为29.88。Wilcoxon-Mann-Whitney检验均显示有显著差异。
图1. 由FTmap确定的复杂与简单的结合位点热点结构示例
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bRo5蛋白靶标的扩展配体数据集
Doak等人对于每个靶标仅描述了一种特定的临床药物。为了研究蛋白质如何与不同的配体结合，作者分析了所有在PDB库中与所研究靶标有至少90%序列同一性的蛋白-配体复合物结构，且库中记录了结合亲和力的信息。扩展的数据集包括具有结构数据的1499个配体-蛋白质复合物。将所有MV>500的配体标记为“延伸Ro5”（eRo5）或bRo5，前者为500<MW<700Da和ClogP<7.5其他满足五规则的化合物，后者为分子量大于700或违反了任何Ro5标准及eRo5限制的配体。用这个标准将靶标集分为23个具有eRo5配体的靶标和14个具有bRo5配体的靶标。利用该拓展配体数据集探索MV>500Da的药物为什么在临床试验中通常比较小的候选化合物更成功的原因。所有配体的亲和力（KD,KI,IC50）被转换为pBA，其值大于7被认为配体具有高亲和力。
具有复杂热点结构的靶标
作者主要依据结合亲和力与MW之间的相关性将24个具有复杂热点结构的靶标进一步分为COMPLEX I和COMPLEX II，前者的结合亲和力与配体分子量之间呈正相关，而后者则不存在这种相关性。此外，24个靶标中有8个因其有结合数据的配体-蛋白质结构太少而被归为COMPLEX III，这一组靶标将被用于讨论开发eRo5/bRo5药物的可能性。
图2.与eRo5/bRo5结合的COMPLEX I，II，简单结构靶标及其配体的特征示例
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Complex I靶标 (配体活性与分子量正相关)
该组有9个靶标，分别为Thrombin，Renin，E3 ubiquitin-protein ligase，p38 MAPK，HIV-1 Aspartic Protease，Hsp90，MEK1，BRD4和PPARγ。凝血酶的bRo5配体Argatroban相对于满足Ro5的配体GR157368而言，结合更多的热点且具有更高的亲和力。根据FTmap，凝血酶在抑制剂结合位点具有5个结合热点，共有57个探针簇，其配体表现出pBA与MW之间的正相关关系。众所周知，低分子量的凝血酶抑制剂存在选择性差，固有毒性，代谢不稳定和口服生物利用度差等缺点，bRo5配体则由优异的药物特性，经分析，可能是因为bRo5通过占据所有热点而获得大量结合能，从而能折中化合物某些位置上的结合互补性。虽然会带来药学上的不足，但会使配体具有更好的功能结构同时具有足够的整体结合亲和力。另外，bRo5更复杂的结构可能会减少脱靶结合的机会。肾素是另一种典型的Complex I蛋白。FTmap分析指出，62个配体也显示出pBA和MW之间的正相关性。肾素在抑制剂结合位点有6个热点，共74个探针簇。bRo5抑制剂aliskiren是美国FDA批准的唯一可用的肾素直接抑制剂，虽没有最高的亲和力，该抑制剂却因为延伸到了一个狭窄的深处，占据了热点1（15）而具有比拟肽更好的生物利用度。猜测仍然是因为其占据了全部热点而获得的额外结合能改善了药物特性。
图3.经FTmap确定的结合了示例配体的复杂I型靶标的热点结构，蓝色配体代表eRo5/bRo5药物，粉色代表较小的化合物
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E3泛素蛋白连接酶XIAP的bRo5化合物birinapant是一种二价SMAC模拟化合物，目前正在临床试验中用于治疗癌症。FTmap鉴定出的20种XIAP抑制剂均表现出pBA与MW之间的正相关关系，但小化合物（MW<500Da）和eRo5/bRo5均可实现高亲和力。可能不需要结合XIAP中的所有热点来抑制靶标活性。
P38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）有四个热点，配体的pBA和MW也显示出强正相关性。该靶标抑制剂属于III型激酶抑制剂，可与邻近的ATP结合口袋的变构位点结合，这与I和II型抑制剂与靶标的结合方式非常不同。bRo5配体PF-03715455结合全部4个热点达到最高的亲和力，小分子量抑制剂P7B仅结合DFG-out构象中的热点即可达到相当高的亲和力。尽管p38 MAPK仍是具有挑战性的药物靶标，但结合所有热点（包括疏水性变构结合口袋中的热点）的eRo5/bRo5配体实现了最高的亲和力，且可能还有更高的选择性。
Complex II靶标(配体活性与分子量无相关性)
该组有7个靶标，分别为Tyrosine Protein Kinase ABL1，EGFR，ALK，Glucocorticoid Receptor，VEGFR- 2，polo-like kinase 1和HGFR。这些靶标的配体的pBA和MW之间不存在相关性，且通常配体在低分子量（MW<400Da）条件在即可实现高亲和力结合。小分子激酶抑制剂通常结合在DFG-in中的ATP结合位点结合，为较大的抑制剂通常到达仅在DFG-out构像中存在的“后袋”。6个靶标为激酶。对于这些靶标的eRo5/bRo5配体而言，它们的存在并不是为了提高活性，而是为了提高选择性。以ABL1为例进行说明。ABL1抑制剂作为一线药物被用于治疗大多数慢性粒细胞白血病。FTmap显示其DFG-out构象有4个热点，2个位于ATP结合位点附近，两个位于后袋。DFG-in构象有5个热点，均位于ATP结合位点附近。小配体PPY-A可以高亲和力地结合DFG-in构象，而较大的药物nilotinib通过延伸进入DFG-out口袋来利用该构象中的所有4个热点，但是与较小的抑制剂相比，它只能实现略高的结合亲和力。另外的bRo5配体dasatinib，bosutinib和ponatinib也与DFG-out构象中的所有4个热点结合，但较小的抑制剂与它们都有可比的亲和力。这可能是由于热点从DFG-in构象的ATP位置向DFG-out构象的后袋整体转移的原因。为ABL1设计更大的化合物的动机是提高选择性而不是亲和力。
图4.经FTmap确定的激酶DFG-in与DDG-out构象热点结构，粉色代表DFG-in,蓝色配体代表DFG-out
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Complex III靶标
该组有8个靶标，分别为Cyclophilin A，DOT1-like Histone H3 Methyltransferase，Lanosterol 14α-Demethylase，Bcl-2，Isoleucyl-tRNA Synthetase，FKBP12，TLR4和FGFR1。由于该组共结晶结构数量少于9个因此无法构建配体结合图谱，没有试图寻找这些靶标从bRo5配体中获益的原因。
Simple靶标
该组有13个靶标，由于这些靶标在配体结合位点的热点少于三个，这将靶点置于可药的阈值。这些弱结合位点通常位于深腔或狭窄峡谷中，或者与其他热点隔离开来。FTmap分析显示一些具有简单热点结构的靶标，其配体在pBA和MW之间显示正相关，而另一些则没有。
驱动蛋白Eg5有3个结合热点，它们在相当深的口袋中紧紧相邻。28个配体中，每个配体都与结合位点的3个热点结合，分子量在274到517Da之间，且pBA和MW之间存在正相关关系。临床候选药物ispinesib是bRo5配体，与热点的重叠相比其他配体更强，更深地进入结合口袋，并与腔壁作用从而产生更高的结合亲和力。
HMG-CoA还原酶也有三个热点，19个配体的分子量从408到655Da不等，与驱动蛋白EG5配体不同的是，HMG-CoA还原酶配体的pBA和MW之间没有任何相关性。bRo5化合物阿托伐他汀与腔壁作用并具有可接受的结合亲和力（MW:558.64Da,pBA=8.21）,而已知最小的他汀类药物美伐他汀也占据三个热点且具有足够的结合亲和力（MW:408.53Da,pBA=7.64）。
图5.经FTmap确定的结合了示例配体的简单型靶标的热点结构，蓝色配体代表eRo5/bRo5药物，粉色代表较小的化合物
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总结
这项研究的目的是了解为什么某些靶标会从违反传统Ro5标准的药物中受益，借助Doak等人研究的具有eRo5/bRo5配体的37种靶标，为其创建了更大的配体库。使用FTmap对靶标的结合热点进行分析发现可将这些靶标分为“复杂”和“简单”两类。在结合谱的支持下，作者发现具有复杂热点结构的靶标，能够通过eRo5/bRo5配体获得更好的亲和力并改善药物特性比如选择性及毒性。具有简单热点结构的靶标，提高结合力是其利用eRo5/bRo5配体的常见动机。这些数据鼓励在针对化学易加工的靶标设计配体时考虑使用bRo5配体，该方法也适用于低可药性靶标。
参考文献
Egbert, M.; Whitty, A.; Keseru, G. M.; Vajda, S., Why Some Targets Benefit from beyond Rule of Five Drugs. Journal of medicinal chemistry 2019.