引言
AZD9291也称为奥希替尼, 是治疗非小细胞肺癌（NSCLCs）的三代靶向药，对具有T790M介导耐药性的表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌具有高度的疗效。尽管AZD9291作为“明星”产品，但由于与EGFR T790M突变激酶的结合方式尚未确定，所以关于AZD9291对T790M突变体的耐受性和优先结合机制仍不明确。在这里，作者采用分子动力学（MD）模拟，观察到AZD9291可与T790和T790M突变体的EGFR激酶自发结合。模拟生成的结构模型表明，AZD9291与T790M的结合模式与T790不同，AZD9291与T790M中的门控残基（Met790）形成范德华相互作用，而与T790中的Thr790没有相互作用，这解释了AZD9291与T790M的结合具有更高的亲和力。最后实验测定的AZD9291与EGFR T790M复合晶体结构和MD模拟生成的模型是一致，进一步验证了MD模拟的结果的可靠性。作者认为，结合模式上看似微小的差异，可能会产生实质性的影响，因此了解AZD9291选择性的结构基础可能会大大有助于此类新药的开发。
先睹为快
作者信息
北京大学基础医学院生物物理系云彩红教授
David E. Shaw Research Group的单一兵教授和David E. Shaw
靶点
EGFR L858R (简称T790)、EGFR L858R/T790M (简称T790M)
计算方法
分子动力学模拟（MD simulations）
计算流程
为了研究AZD9291与EGFR激酶之间的相互作用，作者对AZD9291与T790M和T790的自发结合过程进行了无偏MD模拟。MD模拟从未结合态开始，将三个AZD9291分子任意放置在模拟系统中。每个体系都平行跑了17个模型，时长均为10µs。通过对MD轨迹的分析，探究AZD9291与EGFR的相互作用特征。
AZD9291与EGFR T790M的结合机制研究
为了研究AZD9291与EGFR激酶之间的相互作用，作者对AZD9291与T790M和T790的自发结合过程进行了无偏MD模拟（图1a）。MD模拟都是从未结合态开始，将三个AZD9291分子任意放置在模拟系统中。作者首先模拟了AZD9291与T790M的结合，在17个独立的时长10µs模拟中，观察到8个结合状态（图1d）。如图1c, 其中有4个模拟轨迹中，AZD9291分子呈现稳定的翻转构象（flipped），即吲哚的苯环指向门控残基。其他4个体系，AZD9291以未翻转的方式(un-flipped)结合，类似于之前报道的晶体结构。两种构象的相同点在于都维持了AZD9291与Met 793的“铰链”氢键，不同之处在于，在翻转构象下，吲哚部分旋转约180°，使得吲哚的苯基指向Met 790的侧链。接着作者模拟了AZD9291与T790的结合，同样进行17个独立的10µs模拟，8个AZD9291分子达到了稳定的结合状态。模拟结果显示，在这8个结合状态中，有7个是未翻转的状态（图1c）。
图1. AZD9291与T790和T790M的 MD模拟结果
图片来源于JMC
进一步分析结合过程，AZD9291首先以非翻转构象进入结合位点，进入结合位点后，AZD9291和结合位点的构象均出现明显波动，当AZD9291采用翻转构象后，波动开始减弱（图1b）。AZD9291在进入结合位点并接近Met790后，采用翻转构象的事实表明，T790M通过与AZD9291在结合过程中相互作用来诱导翻转姿势。并且，翻转构象可为自由能（~0.4 kcal mol−1）提供有利的熵贡献。同时，作者发现AZD9291对EGFR的不同结合模式，不仅可以稳定复合物结构，还促进了共价键的形成。作者测量了Cys797的巯基和AZD9291弹头之间的距离（图2），来衡量共价键形成的效率，结合模式中翻转构象中的距离明显小于未翻转构象(分别小于4 Å 和7 Å)，说明翻转构象促进了共价键的形成，更有利于米氏复合物的形成。
图2. MD模拟过程中AZD9291的弹头与Cys797（SG）的距离分布
图片来源于JMC
最后，作者通过实验测定EGFR T790M与AZD9291的复合晶体验证了MD模拟生成的结构模型的可靠性。AZD9291在这种共晶结构中采用的翻转构象与MD模拟中采用的翻转构象相同，此时，吲哚和Met 790侧链之间有利的范德华相互作用可能比未翻转的姿势更强，如图3a所示。值得注意的是，在T790/AZD9291结构中，虽然α C-out的非活性构象在ATP结合位点产生了一个更大的口袋（相对于EGFR的α C-in活性构象），理论上很容易容纳吲哚的翻转，但AZD9291仍然保持未翻转的结合模式（图3b）。这一观察结果再次表明，AZD9291的翻转构象是由T790M中Met790侧链与AZD9291的吲哚基团相互作用引起的。T790M/AZD9291中的EGFR激酶采用了在以前晶体结构中未观察到的独特构象（图4），在这种结构中，C-螺旋是扭结的（kinked），螺旋的N-端半部分（残基753-759）从螺旋的αC-in位移了4-7Å，而其余的C-螺旋（残基760-768）保持αC-in的位置；A-loop的部分残基（残基867-872）形成了一个与N-lobe密切相关的短螺旋（图4c）。尽管具有独特的C-螺旋构象，T790M/AZD9291的整体构象与EGFR的活性构象（图4a，黄色）比非活性构象（图4b，青色）更为相似。
图3. AZD9291在复合晶体结构中的结合模式示意图
图片来源于JMC
图4. T790M/AZD9291中EGFR激酶的独特C-螺旋构象
图片来源于JMC
结论
在这项工作中，作者通过MD模拟和X射线晶体学共同揭示了AZD9291与EGFR激酶T790M突变体的一种先前未知的结合模式。结果可以总结为以下三点：
（i）当AZD9291与EGFR T790M结合时，与野生型EGFR（Thr 790）结合模式相AZD9291倾向于采用另一种结合构象，即吲哚旋转约180º。
（ii）AZD9291以翻转构象与T790M结合时，增加了化合物与Met 790之间的范德华相互作用，可能使其对T790M具有更高的亲和力。
（iii）AZD9291与T790M的翻转结合模式，使化合物的弹头（丙烯酰胺）更接近EGFR 的Cys 797侧链，可能促进化合物与EGFR之间共价键的形成。
参考文献
Xiao-E Yan, et al. Structural Basis of AZD9291 Selectivity for EGFR T790M. J. Med. Chem.(2020).