药物发现的目的是为了寻找具有特定化学特征的新型化合物，这些化合物可以作为先导化合物进一步研究。高通量虚拟筛选（High-throughput Virtual Screening，HTVS）已被证明是一种有前景且资源有效的先导化合物开发工具，为了说明HTVS对制药行业新型化学系列挖掘的积极影响，美国Janssen公司总结了3个应用高通量虚拟筛选方法加速先导化合物开发的研究案例，于2月份发表在JCIM杂志上。这3个前瞻性案例的研究靶标分别是Bruton Tyrosine Kinase (BTK)、RAR-Related Orphan Receptor γ t (ROR γ t)和Human Leukocyte Antigen DR isotype (HLA-DR)。前面我们介绍应用HTVS筛选到六种BTK抑制剂的BTK研究案例以及同源模建获得蛋白结构后应用HTVS筛选到ROR γ t抑制剂的ROR γ t研究案例，今天这篇文章主要为大家介绍HLA-DR研究案例。
背景
II类主要组织相容性复合物（MHC-II）糖蛋白在抗原呈递细胞如B细胞，巨噬细胞和树突细胞的表面共表达。三种人MHC-II分子，人白细胞抗原（HLA）-DR、HLA-DP和HLA-DQ，将抗原肽呈递给CD4 + T细胞并引起抗原特异性CD4 + T细胞活化和免疫应答刺激。每种MHC-II蛋白可以结合多种肽，一些肽也可以结合多种MHC-II等位基因。这种结合控制着抗原特异性反应，即身体抵抗多种可能病原体的特异性免疫反应。HLA-DRB1基因是调控类风湿性关节炎（RA）最重要的风险因素。由RA相关的HLA-DRB1等位基因编码的分子在DR-β链中共享一个共同的氨基酸序列，称为共有表位（SE），85％的RA患者携带至少一个MHC II类风险等位基因。因此，靶向HLADR、抗原肽和T细胞受体（TCR）之间的相互作用是阻止RA产生的关键。
HLA-DR蛋白是由α链和β链组成的异二聚体，如图1所示。每个亚基由两个细胞外结构域组成，即跨膜结构域和细胞质尾部。如图中晶体结构PDB ID 1J8H所示，当与TCR复合时，TCR位于肽结合口袋的正上方，并与MHC-II和肽接触。肽结合口袋是暴露于溶剂的大开放腔，由子袋P1-P9组成。肽的结合特异性来自与一系列相对深的疏水子袋（由等位基因特异性多态性残基组成）的相互作用，为给定等位基因的每个给定口袋提供不同的化学环境。P1口袋是最大且最重要的用于结合抗原肽的位点，而P4在SE中被观察到具有高可变性。
图1. 与人α/βT细胞受体和流感HA抗原肽（PDB ID 1J8H）复合的HLA-DR4的结构。
对于PPI靶标，筛选阻止关节炎肽表面呈递的小分子抑制剂是特别具有挑战性的。结合位点是大的溶剂暴露的口袋，其对于实现小分子抑制剂置换抗原肽提出了挑战。虽然目前已有HLA-DR4 / DR1的有效肽模拟抑制剂，但迄今为止报道的HLADR4的小分子抑制剂41只有非常低的抑制效力（17-50μM），突显了其小分子抑制剂筛选的难度。
口袋评估和验证
迄今为止，没有已知的HLA-DR共晶结构可用于小分子对接。因此，虽然结合口袋的位置是已知的，但如前所述，该部位非常大，暴露于溶剂中并包含九个子袋P1-P9。研究者首先使用vMAP23对口袋体积进行分析，以确定哪个子袋最适合于小分子结合并以此进行虚拟筛选。HLA-DRB1 * 04:01（PDB ID 4MD4）和HLA-DRB1 * 04:04（PDB ID 4MD5）等位基因被选择用于该研究，因为它们含有由> 80％的RA群体携带的SE。
如图2所示，研究者在HLA-DRB1 * 04:01和HLA-DRB1 * 04:04结构中找到了三个不同的子袋：P1、P4和P9。P1及其相邻的子袋区域具有约800 Å3的体积和两个等位基因的显着疏水体积。P4和相邻的子袋区域在HLA-DRB1 * 04:01中具有614 Å3的体积，但在HLA-DRB1 * 04:04中体积略大，体积为886 Å3。P1和P4一起为小分子设计提供了显着的体积和多样化的锚点。对于HLA-DRB1 * 04：01、P9及其相邻的子袋区域的体积为1166 Å3，其中282 Å3位点暴露于溶剂。但是，这个口袋在HLA-DRB1 * 04:04中较小，体积为48 Å3（暴露于溶剂中为101 Å3）。该口袋还具有显着的疏水体积。基于该分析，可以得出结论，P1是具有显着体积的最深口袋，并且可能是HTVS的最佳口袋
图2. 口袋体积分析以确定适合HLA-DR4：01和HLA-DR4：04的小分子结合口袋。
为了验证由vMAP23识别的口袋，使用Glide-SP完成了七次小型无限制对接。将一组11K化合物（完全随机）对接到每个口袋中。对接结果显示，将化合物对接至HLA-DR4：01和HLA-DR4：04中的P1和P9任一结合位置，化合物获得对接打分都很低，很少一部分化合物被定义Hits。另外，将P4-P9的口袋合并用于HTVS，获得对接结果和P1或P9单独对接结果类似。然而，P1-P4的组合口袋用于HTVS，HLA-DR4：01和HLA-DR4：04都能产生许多具有合理打分的Hits。因此，最终选择P1-P4组合口袋作为HLA-DR4：01和HLA-DR4：04的抑制剂结合位点。
HTVS鉴定出与HTS类似的理想化合物
研究者应用Glide-SP对接方法，以HLA-DR4：01和HLA-DR4：04为受体，虚拟筛选了Janssen数据库中的1,033,001个化合物。保留与HLA-DR4：01对接后GlideScore < -8.5的化合物（12,919），与HLA-DR4：04对接后GlideScore < -8.25的化合物（6,722）。将保留的化合物合并，且消除重复的化合物，应用各种过滤器，例如HTS过滤器对化合物进行过滤。然后使用Pipeline Pilot专有聚类方法对得到的12,972个分子进行聚类分析，获得7,260种化合物的聚类库，并进行HTS初级评估。在这些化合物中，63％（4,587 Hits）已经是HTS筛选库的一部分，计划与HTVS一起进行筛选; 因此，如果仅使用HTS作为鉴定方法，则会缺失2,673种其他化合物。
在HTVS优先考虑的7,260种重要化合物中，以50％抑制实验确认了199种活性物，最终的命中率为2.7％。相比之下，在HTS筛选中的632,000种化合物中，确认了1,529 Hits，命中率为0.2％。研究者指定了502种化合物（其中11种由HTVS鉴定），以便根据IC50值和化学结构进一步分析，以确保易处理性。完成502种化合物的聚类分析以确认该组的多样性。使用专有聚类方法，0.5相似性水平有145个聚类，每个聚类中位数为2个化合物。25.5％的簇是单化合物，23.4％的簇包含4到69种化合物。
最终研究者确定了5个系列的先导化合物。这5 各化合物中有3个由HTVS和HTS共同定义，有2个单独由HTS定义。从HTS和HTVS鉴定的原始命中的HTRF IC50值分别为3.31μM、4.72μM和5.78μM，仅HTS鉴定的化合物的HTRF IC50值分别为1.50μM和6.06μM。虽然HTVS在502种指定化合物中只占了11个化合物，但是却有3个化合物（27%）被用作先导优化的化合物，这说明虚拟筛选可以鉴定具有多种化学结构的富集化合物列表，适合作为潜在的候选药物。将化合物进一步优化至纳摩尔细胞效力并基于对接模型，假设结合在P1-P4子袋中，如图3所示。预计该系列化合物将占据P1子袋，类似于肽抗原并跨越P4子袋。
图3. 应用代表化合物（深蓝色）预测得到的结合模式。HLA-DR显示为绿色，与橙色的肽结合（PDB ID：4MD4）。TCR位于结合裂缝的顶部（黄色; PDB ID：1J8H）。
高效的虚拟筛选
在这个案例中，约100万个化合物被用于HTVS，经过仔细的筛查，一个由7,260种化合物组成的子库被认为具有适当的大小和化学功能，可以通过实验进行测试。与此同时，632,000种随机、多样化合物在HTS中进行了实验测试。两种方法都确定了先导化合物，但是应用HTVS获得的具有多种化学结构的子库进行实验测试，可以大大提高活性化合物发现的成功率。
文章来源：
Kelly L. Damm-Ganamet, Nidhi Arora, Stephane Becart, et. “Accelerating Lead Identification by High Throughput Virtual Screening: Prospective Case Studies from the Pharmaceutical Industry” Journal of Chemical Information and Modeling (2019).