药物发现的目的是为了寻找具有特定化学特征的新型化合物，这些化合物可以作为先导化合物进一步研究。高通量虚拟筛选（High-throughput Virtual Screening，HTVS）已被证明是一种有前景且资源有效的先导化合物开发工具，为了说明HTVS对制药行业新型化学系列挖掘的积极影响，美国Janssen 公司总结了3个应用高通量虚拟筛选方法加速先导化合物开发的研究案例，于2月份发表在JCIM杂志上。这3个前瞻性案例的研究靶标分别是Bruton Tyrosine Kinase (BTK)、RAR-Related Orphan Receptor γ t (ROR γ t)和Human Leukocyte Antigen DR isotype (HLA-DR)。今天这篇文章主要为大家介绍BTK研究案例。
背景
BTK是一种Tec酪氨酸激酶，而且是NF-kB通路中许多凋亡蛋白的上游激活剂。由于BTK在B细胞增殖，分化，功能和信号传导中起关键作用，因此它被认为是调节免疫细胞功能，治疗B谱系淋巴瘤和治疗类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的重要靶点。目前BTK的抑制剂有很多种，人们通过抑制剂与蛋白上不同口袋的结合构象将这些抑制剂分成不同类型。研究者想开发新化学型的BTK抑制剂，这个项目的挑战在于要在非常拥挤的化学领域开辟一个新的化学空间。
基准测试以及口袋优化
研究者选择了两个高分辨率的BTK晶体结构3OCS（1.8 Å）和3PJ3（1.85 Å）进行筛选。两个晶体结构中配体抑制剂的结合位置不同，如图1所示。随后，进行自身对接（将配体对接到其自身的晶体结构受体中）和交叉对接（将一系列配体对接到相同受体的不同晶体结构中）实验，从而筛选最佳的对接方法。最终方法选择如下：
3PJ3：应用Glide-SP方法。
3OCS：首先应用FRED初筛，再应用Glide-XP方法对排名前30%的化合物进行二次筛选。
图1. （A）3OCS与配体的在口袋中的结合情况；（B）3PJ3与配体的在口袋中的结合情况
通过HTVS获得结构多样且有效的BTK抑制剂
研究者对Janssen数据库中891,982个化合物进行了筛选。其中基于3PJ3结构筛选获得4970个Hits，基于3OCS结构筛选获得2047个Hits（删除重复项）。随后对这些化合物进行聚类分析，选中5547个化合物，使用ThermoFluor在靶点结合实验中进行评估。评估结果如表1所示。最终将选定的代表性化合物展示于表2中，突出了所获得化合物的活性和多样性。
表1. 对HTVS获得的化合物进行ThermoFluor结合亲和力检测结果
表2. HTVS筛选获得的6个代表性化合物以及相应的ThermoFluor和HTMS数据
应用HTVS做精准的结合模式预测
通过筛选，获得Compound 1（HTMS IC50=0.04µM）与BTK的复合物结构。Compound 1与受体的结合模式与受体自身配体的叠合情况展示于图4，两者的结合模式非常相似，RMSD=2.92 Å。这说明所选择的对接工具可以精准预测化合物与蛋白的结合模式。
图2.（A）预测获得的Compound 1与BTK蛋白自身配体(PDB ID: 6NFH)的叠合情况；（B）预测获得的Compound 5与BTK蛋白自身配体(PDB ID: 6NFI)的叠合情况
应用TF-HTS和Cell-HTS方法补充 HTVS中未识别的Hits
为了全面地识别可能漏掉的抑制剂，随后为BTK运行两个高通量筛选。研究者应用ThermoFluor（TF-HTS）方法筛选了302,465个化合物，获得2083个Hits（命中率为0.68%）。同时用Ramos Cell-based FLIPR Assay（Cell-HTS）筛选了433,657个化合物，获得1693个Hits（命中率为0.4%）。这两种筛选方法对应的数据库与之前HTVS筛选（命中率14.3%）的Janssen化合库有重合，TF-HTS有70.2%的数据（197,984）与HTVS重合，Cell-HTS有81.7%的数据（354.209）与HTVS重合，三者有46.8%（132,008）化合物重合。
比对HTVS、TF-HTS和Cell-HTS三种筛选方法所获得的命中率，虽然在TF-HTS和Cell-HTS试验中筛选了更多的化合物，但HTVS能显着提高了资源效率，与TF-HTS相比，命中率提高了21倍，与Cell-HTS相比，命中率提高了36倍。
总结
该研究团队从HTVS中选择了表2中的六种BTK抑制剂，作为接下来研究的先导化合物系列。这个案例研究表明，当利用文献中提供的大量结构和配体结合数据进行严格的基准测试来优化富集时，可以有效地利用HTVS来识别潜在的活性化合物。
敬请期待案例（二）和案例（三）……
文章来源
Kelly L. Damm-Ganamet, Nidhi Arora, Stephane Becart, et. “Accelerating Lead Identification by High Throughput Virtual Screening: Prospective Case Studies from the Pharmaceutical Industry” Journal of Chemical Information and Modeling (2019).